Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы

S Ч Уni

N общ. = zЧ sЧv Ч100 [кл/г], где

S - общая площадь окрашенного на стекле препарата (225 мм2);

Уni - сумма подсчитанных под микроскопом микробных клеток;

z - количество просмотренных полей зрения (15);

s - площадь одного поля зрения (1089Ч10-6 мм2);

v - объем образца воды, затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);

100 - разведение первоначального образца почвы в 100 раз.

Опыт проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.

1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов

Определение количества клеток сапротрофов (Nсапр.) проводили высевом на жидкую питательную среду - мясо-пептонный бульон (МПБ) [6]. Для приготовления МПБ использовали стандартную питательную среду (ИЛО «Питательные среды»). Состав МПБ, г/л: панкреатический гидролизат кильки - 17,9; NaCl - 7,7 ± 0,3; вода дистиллированная - 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с использованием таблиц Мак-Креди [7]. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10-1 до 10-7. Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28 0С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки [6;7].

Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего состава [11]: Na2HPO4 - 0,8 г; KH2PO4 - 0,5 г; NH4Cl - 0,5 г; MgSO4 - 0,2 г; CaCl2 - 0,1 г; FeSO4Ч7H2O -15 мг; дрожжевой экстракт - 0,1 г ; пептон - 0,2 г; агар - 15 г; глюкоза - 0,2 г; вода дистиллированная - 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность олиготрофов (Nолиг.) определяли методом высева по Коху [7]. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10-1 до 10-9. По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом определяли значимость различий двух повторных определений по критерию ч2, рассчитываемому по формуле [7]:

(ni - n)2

ч 2 = п ,

где пi - число колоний, выросших на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п - их среднее значение.

Различие считается значимым при ч 2 не менее 3,841. Пересчет числа выросших колоний (п) на численность бактерий соответствующей группы (N) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали формулу:

nЧr

Nолиг. = v [кл/г],

где п - среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r - величина разведения; v - объем образца, посеянного на чашку (мл).

Кроме того, рассчитывали отношение Nсапр. к Nобщ. для каждого горизонта.

2 Результаты и обсуждение исследования

Результаты начального этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении 2 и на рисунке 1.

Таблица 1

Общая численность бактерий в почвенном профиле

дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Рис. 1. Динамика общей численности бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N - численность бактерий

(Ч 109 кл/г почвы).

Как видно из табл. 1 и рис. 1, максимальное значение общей численности бактерий (Nобщ.) - 6,2Ч109 кл/г - наблюдали во втором горизонте, по сравнению с остальными четырьмя горизонтами. Этот факт можно объяснить тем, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества. Третий горизонт почвенного профиля уже более уплотнен, поэтому органическое вещество, накапливаясь во втором горизонте, является фактором, стимулирующим развитие в нем почвенных микроорганизмов.

Данные табл. 1 показывают, что Nобщ. достоверно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта: от второго к пятому, самому нижнему. Полученный результат согласуется с тем фактом, что содержание органического вещества, необходимого для развития почвенных микроорганизмов, также снижается с увеличением глубины залегания горизонта. При переходе от верхнего горизонта к нижележащим изменяются также окислительно-восстановительные условия, pH и др.

Порядок величин Nобщ. в каждом горизонте был одинаков - 109 кл/г. По-видимому, в верхних более рыхлых горизонтах, куда поступает достаточное количество кислорода с поверхности, создались оптимальные условия для развития аэробных микроорганизмов. В нижележащих горизонтах содержание кислорода минимально, и прежний порядок значения Nобщ. объясняется активным развитием анаэробов.

Численность сапротрофных бактерий (Nсапр.) уменьшалась от первого горизонта к третьему, причем резкое снижение численности - более чем в 6 раз - было отмечено при переходе от первого ко второму горизонту (рис. 2А). Nсапр. (таб.2) в четвертом горизонте - 4,5Ч104 кл/г - была незначительно выше, по сравнению с третьим - 2,0Ч104 кл/г, - тогда как в пятом она опять понижалось до значения, отмеченного в третьем горизонте (рис. 2А). Как показано на рис. 2Б, численность олиготрофных бактерий (Nолиг.) последовательно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5Ч107 в первом до 1,5Ч107 кл/г в пятом горизонте (таб.2).

Рис. 2. Численность сапротрофов (А) и олиготрофов (Б) в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N - численность бактерий (кл/г почвы)

Таблица 2

Численность сапротрофных и олиготрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы

В общем, Nсапр. находилась на уровне 105 кл/г в первом, и 104 кл/г в остальных горизонтах (прил. 3). Nолиг. соответствовала 107 кл/г в каждом горизонте профиля. Таким образом, Nолиг. была меньше, чем Nсапр.: в первом горизонте в 100, а в остальных четырех - в 1000 раз. Выявленное значительное преобладание олиготрофов над сапротрофами свидетельствует о том, что в исследованной почве низкое содержание легкоразлагаемой органики [2], следовательно, данная почва не подвергалась антропогенному загрязнению. Бактерии функционируют в ней за счет органического вещества самой почвы. Сапротрофы, развивающиеся в условиях высокой концентрации органики [3;4], уже переработали ее большую часть. В настоящее время в исследованной почве доминируют олиготрофы, которым для существования необходимо низкое содержание органики в среде [2;4].

Интересным является факт, что для горизонтов с четвертого по пятый отмечаются признаки оглеения почвы - сизые и голубые пятна и затеки. В настоящее время известны три совокупные причины глеегенеза [5]: 1) высокая влажность; 2) наличие легкоразлагаемого органического вещества в избыточном количестве; 3) жизнедеятельность гетеротрофных микроорганизмов. Согласно нашим результатам, процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании в микробоценозе олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка органического вещества.

Отношение Nсапр. к Nобщ. составило величины порядка 10-4 - 10-5 (табл.3), что свидетельствует о климаксном состоянии микробоценоза [3] и о доминировании бактерий, которые получают необходимые питательные вещества и энергию за счет использования трудноразлагаемых органических веществ почвы в течение длительного времени.

Таблица 3

Отношение общей численности к численности сапротрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Примечание: Nсапр. - численность сапротрофных бактерий (кл/г); Nобщ. - общая численность бактерий (кл/г).

Заключение

1. Общая численность бактерий снижается с глубиной залегания почвенного горизонта, максимальное значение - 6,2Ч109 кл/г - наблюдается во втором горизонте за счет того, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества.

2. Количество сапротрофных бактерий уменьшалось от первого горизонта к третьему - от 2,5Ч105 до 1,4Ч104 кл/г, - причем резкое снижение численности - более чем в 6 раз (от 2,5Ч105 до 4,0Ч104 кл/г) - было отмечено при переходе от первого ко второму горизонту.

3. Численность олиготрофных бактерий последовательно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5Ч107 в первом до 1,5Ч107 кл/г в пятом горизонтах.

4. Отношение численности олиготрофных бактерий к сапротрофным для первого горизонта составляет величину порядка 102, а в остальных четырех - 103, что свидетельствует о значительном преобладании олиготрофов над сапротрофами.

5. Отношение численности сапротрофных бактерий к общей численности бактерий составляет величины порядка 10-4 - 10-5, что свидетельствует о климаксном состоянии микробоценоза и о доминировании бактерий, жизнедеятельность которых связана с использованием трудноразлагаемых органических веществ почвы.

6. Согласно нашим результатам, процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании в микробоценозе олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка органического вещества.

Список использованных источников и литературы

1. Бабьева И.П. Биология почв / И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. - М.: МГУ, 1989. - 336 с.

2. Емцев В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. - М.: Дрофа, 2005. - 445 с.

3. Добровольская Т.Г. О показателях структуры микробных сообществ / Т.Г. Добровольская, И.Ю. Чернов, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. - 1997. - Т.66. - №3. - С. 408-414.

4. Заварзин Г.А. Введение в природоведческую микробиологию / Г.А. Заварзин, Н.Т. Колотилова. - М.: Книжный дом «Университет», 2001. - 256 с.

5. Зайдельман, Ф.Р. Процесс глееобразования и его роль в формировании почв / Ф.Р. Зайдельман. - М.: МГУ, 1998. - 316 с.

6. Кузнецов С.И. Методы изучения водных микроорганизмов / С.И. Кузнецов, Г.А. Дубинина. - М.: Наука, 1989. - 288 с.

7. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. - М: МГУ, 1976. - 307 с.

8. Соединения железа, алюминия, кремния и марганца в почвах лесных экосистем таежной зоны / М. Мурашкина, Г. Копцик, и др. // Почвоведение. - 2004. - № 1. - С. 40- 49.

9. Умаров М.М. Экология и почвы / М.М. Умаров. Избранные лекции 1-7 школ, М.: Пущино, 1998, 15-21 с.

10. Экология микроорганизмов: учебник / А. И. Нетрусов, Е.А. Бонч - Осмоловская, и др. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272с.

11. Hottes A.K. Transcriptional profiling of Caulobacter crescentus during growth on complex and minimal media / A.K. Hottes, M. McEwen, D. Yang et al. // J. Bacteriol. - 2004. - V. 186. - №5. - P. 1448-1461.